Gentaur Ελλάδα – Βιοτεχνολογία: Πρωτεΐνες, ELISA, Αντισώματα

Τεχνική RISA – Ανάλυση ριβοσωμικών διαγονιδιακών αλληλουχιών

Τι είναι η RISA?

Η RISA, ή ανάλυση ριβοσωμικών διαγονιδιακών αλληλουχιών, χρησιμοποιείται για την ανάλυση διαφορετικών τύπων μικροοργανισμών. Χρησιμοποιείται για τη σύγκριση βακτηριακών καλλιεργειών που διακρίνονται από το είδος του περιβάλλοντος στο οποίο ζουν ή από τη μέθοδο επεξεργασίας τους. Πρόκειται για μια μέθοδο που λειτουργεί χωρίς προκατάληψη σε προσεγγίσεις που εξαρτώνται από την καλλιέργεια. Είναι επίσης γνωστή ως «αποτύπωση μικροβιακής κοινότητας» (community fingerprinting).

Ροή διαδικασίας

Η τεχνική RISA βασίζεται στην ενίσχυση με PCR της περιοχής του οπερονίου του γονιδίου rRNA που βρίσκεται μεταξύ της μικρής (16S) και της μεγάλης (23S) ριβοσωμικής υπομονάδας. Αυτή είναι η λεγόμενη διαγονιδιακή περιοχή διαχωρισμού (ISR). Με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών που στοχεύουν συντηρημένες περιοχές των 16S και 23S, μπορούμε να δημιουργήσουμε θραύσματα RISA από τα περισσότερα κυρίαρχα βακτηριακά γονίδια σε ένα περιβαλλοντικό δείγμα. Σε αντίθεση με το μεγαλύτερο μέρος του οπερονίου rRNA, το οποίο έχει δομική λειτουργία, τα θραύσματα RISA μπορούν να κωδικοποιούν tRNA ανάλογα με το βακτηριακό είδος. Ωστόσο, η ταξινομική αξία των ISR οφείλεται στη μεγάλη ετερογένεια τόσο στο μήκος όσο και στην αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Στη RISA εκμεταλλευόμαστε την ετερογένεια του μήκους των ISR, η οποία έχει αποδειχθεί ότι κυμαίνεται από 150 έως 1500 bp. Το προϊόν που λαμβάνεται με PCR είναι ένα μείγμα θραυσμάτων που προέρχονται από αρκετά κυρίαρχα άτομα ενός είδους. Αυτό το προϊόν υποβάλλεται στη συνέχεια σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης και το DNA οπτικοποιείται μετά από χρώση. Το αποτέλεσμα της ηλεκτροφόρησης είναι ένα πολύπλοκο πρότυπο ζωνών που παρέχει ένα προφίλ ειδικό για το είδος, όπου κάθε ζώνη DNA αντιστοιχεί σε έναν συγκεκριμένο βακτηριακό πληθυσμό. [caption id="attachment_155" align="alignnone" width="175"] Ροή διαδικασίας

Τι είναι η μέθοδος διαδικασίας RISA[/caption]

Τι είναι η τεχνική αποτυπώματος (fingerprint)?

Η τεχνική αποτυπώματος είναι μια εργαστηριακή μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της πιθανότητας ταυτοποίησης ενός ατόμου με βάση τις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων συγκεκριμένων περιοχών του ανθρώπινου DNA που είναι μοναδικές για κάθε άτομο. Η δειγματοληψία DNA χρησιμοποιείται σε διάφορες περιπτώσεις, όπως σε ποινικές έρευνες, άλλες εγκληματολογικές εφαρμογές και τεστ πατρότητας. Σε αυτές τις περιπτώσεις, αναζητείται ταύτιση μεταξύ δύο δειγμάτων DNA. Η χρήση τεχνικών αποτυπώματος προσφέρει τη δυνατότητα αξιολόγησης της παρουσίας διαφορών μεταξύ μικροβιακών πληθυσμών, αλλά δεν παρέχει άμεσο προσδιορισμό της ταξινομικής τους κατάταξης. [caption id="attachment_156" align="alignnone" width="225"] Τι είναι η τεχνική αποτυπώματος (fingerprint)?

Τι είναι η μέθοδος RISA και η τεχνική αποτυπώματος[/caption]

Τι μπορούμε να ταυτοποιήσουμε με τη RISA?

Με τη RISA μπορούμε να ταυτοποιήσουμε το Enterococcus cecorum. Ανήκει στην ομάδα των ευκαιριακών παθογόνων και μπορεί να λειτουργήσει ως αιτιολογικός παράγοντας ασθενειών στον άνθρωπο (κυρίως νοσοκομειακές λοιμώξεις), στα κοτόπουλα και στα περιστέρια. Πρόσφατα, αυτό το βακτήριο φαίνεται να αποτελεί απειλή για τη βιομηχανία πουλερικών παγκοσμίως. Η μόλυνση με αυτό το βακτήριο στα κοτόπουλα μπορεί να προκαλέσει σηψαιμία, ενδοκαρδίτιδα ή, σε σοβαρές περιπτώσεις, νέκρωση εγκεφάλου και εγκεφαλομαλακία. Το βακτήριο σπάνια προσβάλλει τον ανθρώπινο οργανισμό, αλλά υπάρχουν περιπτώσεις μόλυνσης σε μετεγχειρητικές κήλες και αποικισμού στο ουροποιητικό σύστημα.